Cromatografía de columna convencional
2. columna cromatográfica (tipo de rotación)
3. columna cromatográfica (manual)
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Descripción
Parámetros técnicos
Cromatografía de columna convencionalUtiliza la diferencia en las relaciones de distribución de diferentes sustancias entre la fase estacionaria y la fase móvil, o las diferentes capacidades de retención de fases fijas en relación con diferentes sustancias, para lograr la separación de sustancias. Cuando la mezcla fluye a través de la columna cromatográfica con la fase móvil, interactuará con la fase estacionaria en la columna (como disolución, adsorción, etc.). Debido a las diferencias en las propiedades y estructuras físicas y químicas de cada componente en la mezcla, la magnitud y la resistencia de sus interacciones con la fase estacionaria también varían. Bajo la misma fuerza impulsora, el tiempo de retención de cada componente en la fase estacionaria es diferente, de modo que los componentes en la mezcla fluyen fuera de la columna en un cierto orden, logrando la separación.
Parámetro
Detección de residuos de pesticidas
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A menudo decimos queCromatografía de columna convencionalen realidad es la separación de la cromatografía en columna, también conocida como cromatografía de columna. Primero fue inventado y utilizado por científicos rusos en 1903. Aplastó una solución de pigmentos vegetales en polvo de carbonato de calcio y encontró diferentes bandas de color en el polvo de carbonato de calcio de arriba a abajo. Al separar y extraer diferentes bandas de color, se obtuvieron clorofila relativamente pura, luteína, etc.
Después de cien años de desarrollo, este método se ha vuelto relativamente maduro, y la fase estacionaria también ha evolucionado de un solo polvo de carbonato de calcio a alúmina (que se puede dividir en ácido, neutral, alcalino), síma de sílice gel, carbono activado, etc. Entre ellas, el gel de sílice es el más comúnmente utilizado en laboratorios mayores, generalmente divididos en gel de fase de fase normal y fase reversa gel de fase milica gel.
La fase estacionaria (gel de sílice) generalmente debe purificarse y activarse, y el tamaño de partícula debe ser uniforme. En teoría, cuanto más pequeño sea el tamaño de partícula y cuanto mayor sea el área de superficie por unidad de masa, mayor será la capacidad de adsorción y mejor será el efecto de separación.
Sin embargo, en uso práctico, cuando las partículas de fase fija son demasiado pequeñas, a menudo hay dos situaciones: una es que son más livianos en peso y flotan fácilmente en el aire (el cuerpo humano no puede degradar fácilmente (el cuerpo humano, y más fino, más tóxico es); En segundo lugar, las partículas pequeñas también pueden conducir a pequeños espacios entre partículas, lo que resulta en una velocidad de flujo de disolvente lenta y consumo de tiempo; Tomando la silicona como ejemplo, el mayor tamaño comercialmente utilizado de silicona es actualmente 200-300 malla.
En términos de métodos de aprobación de columnas, además del equipo de análisis automático, como la preparación de circulación hacia adelante, la preparación eficiente de la fase líquida y las máquinas de pase de columnas mencionadas anteriormente, el paso manual de la columna se divide principalmente en tres tipos: pase de columna de presión atmosférica, pasamiento de columna de desaceleración y pasamiento de columna de presurización.
Entre ellos, la despresurización a través de la columna produce una eficiencia de adsorción deficiente debido a la velocidad de flujo rápida del eluyente, lo que conduce a la pérdida de la mayor parte del número de bandejas y la mala eficiencia de separación. Es adecuado para separar muestras con placas TLC relativamente abiertas, especialmente para muestras con solo una gran impureza polar en el producto; La mayor parte de su tiempo se gasta en el pretratamiento de compuestos, eliminando algunas impurezas antes de una purificación cuidadosa. Cabe señalar que la evaporación del solvente causada por la presión negativa durante el uso puede conducir a la condensación de una gran cantidad de gotas de agua en la superficie externa de la columna. Los compuestos sensibles al agua no deben intentarse fácilmente.
El paso de la columna de presión atmosférica es el método de separación más efectivo entre los tres, pero debido a que el solvente a menudo se mueve demasiado lento, incluso el mejor efecto de separación puede afectar la eficiencia. Por lo tanto, la presión generalmente se aplica en este momento, que se llama pase de columna presurizada; Pero la presión no debe ser demasiado alta. En general, se utiliza una bola de cadena doble para la operación manual, y se utiliza una bomba de pescado para la operación automática. Ambos pueden modificarse como se muestra en la imagen.
Proceso de cruce de columna convencional:
El trabajo de preparación debe hacerse bien:
Al seleccionar una columna, observe si hay un tablero de lijado. Para columnas sin tablas de lijado, recuerde llenar el fondo con un poco de algodón. El algodón no debe ser demasiado grueso o demasiado delgado, siempre que pueda bloquear la silicona. (El blogger desmanteló directamente una percha y la usó para insertar algodón en la salida del enchufe)
¡Prepare el mínimo de polaridad eluente, la lámpara UV (recomendada para el personal de laboratorio, la mano de mano, lista para tomar una foto en cualquier momento), equipos de presión y estante de tubos de ensayo, según sea necesario!
Seleccione una columna adecuada, agregue gel de silicona, remoje el gel de silicona y aplanéelo
La selección decromatografía de columna convencionales muy importante, y su tamaño debe calcularse en función de la cantidad de producto, que generalmente se puede dividir en:
Unos pocos miligramos de columna (la opción final para la síntesis total);
Una columna de varias decenas de miligramos (sustrato de expansión metodológica);
500 miligramos a 1 gramo de columna (utilizando la metodología como materia prima);
Pilares alrededor de 5 g y escamas más grandes.
La relación más común del diámetro de la columna a la altura en el laboratorio es generalmente entre 1: 2.5 y 1:15. La cantidad de gel de sílice utilizada como fase estacionaria durante la carga de la muestra es aproximadamente de 20 a 40 veces la de la muestra. El estándar para seleccionar columnas debe basarse en la situación de escalada de placas TLC de su muestra. Si hay muchas impurezas muy cerca, trate de elegir una columna más grande tanto como sea posible, para que su muestra pueda cubrirse con una pequeña capa delgada (espesor recomendado por debajo de 5 mm). Si las impurezas están lejos, este grosor puede aumentar naturalmente, pero no se recomienda que el grosor de su muestra exceda de 2 cm, a menos que el producto simplemente se lava.
Muchas personas cometen un error al pensar que agregar más silicona, incluso si es más gruesa en mi muestra, ¿se puede separar bien? ¡Esta respuesta es negativa!
La razón es que estas personas nunca pensaron que las muestras de abajo y por encima no funcionaban en la misma línea, por lo que solo pudieron obtener algunas puras, la mayoría de las cuales fueron cruzadas, sin mencionar las impuras, perdiendo el tiempo y los solventes.
¡Es por eso que la muestra requiere adelgazamiento!
Después de seleccionar la columna, agregar silicona se puede hacer a través de un embudo de alimentación. Al mismo tiempo, asegúrese de usar una máscara y operar en una campana de humo. La razón de esto no será elaborada por el blogger (silicosis).
En cuanto a la infiltración de gel de sílice, el proceso recomendado es: primero, coloque la columna de gel de sílice con el gel de sílice instalado verticalmente, aplane la superficie del gel de sílice con la mano, conecte el fondo de la columna de gel de sílice a una bomba de agua, bombee el gel de sílice y luego vierta en el tono más polar de arriba. Cuando el eluyente esté a punto de filtrarse, cierre la válvula de cierre para evitar que el solvente se bombee a la bomba de agua.
Luego, bajo presión, el gel de silicona puede empaparse uniformemente al sonar siete u ocho volúmenes de columnas con la menor cantidad de agente en desarrollo.
Muestra arriba
El muestreo se divide en muestreo húmedo y muestreo seco.
(1) Muestreo húmedo.
El método recomendado es usar una pipeta con una punta de goma para chupar la muestra, cerca de la sección superior del gel de silicona, gotee lenta y uniformemente la muestra hasta que cubra una capa, luego deje de agregar la muestra y aplique cierta presión para sumergir la sustancia aceitosa en la capa de gel de silicona; ¡Sumerja la sustancia aceitosa en la capa de silicona y repita este proceso varias veces hasta que todas las muestras estén cargadas!
Algunos estudiantes nuevos pueden tener curiosidad por qué se lleva a cabo esta operación en lugar de recubrir el aceite húmedo como la sustancia de una vez.
De hecho, esta operación puede reducir la altura efectiva de la capa de muestra. En este punto, la cromatografía de columna ya ha comenzado, y las muestras posteriores son como solventes que empujan las muestras anteriores a adsorb y desorb en gel de sílice.
(2) En cuanto al muestreo en seco.
A menos que sea absolutamente necesario, no se recomienda. Se recomiendan más muestras sólidas para ser golpeadas o cristalizadas. "Se recomiendan métodos sin escrúpulos, acetato de etilo versus agua, cristalización asistida por oscilación ultrasónica del alto aceite de ebullición" y "compartir un método de recristalización de laboratorio".
El muestreo en seco generalmente trae dos problemas; Por un lado, durante el proceso de mezcla de muestras, la posibilidad de reacción entre la muestra y el gel de sílice aumenta debido a la necesidad de elevar la temperatura para la evaporación rotativa; Por otro lado, la carga seca significa que los adsorbentes se introducirán en la capa de muestra, aumentando la altura de la capa de muestra o el tamaño de la columna, que requiere más tiempo y más solvente.
Si no hay otra opción, simplemente vierta el polvo adsorbido lentamente en la columna para su carga, con algunos requisitos similares a los métodos húmedos.
Agregar sulfato de sodio anhidro o arena de cuarzo
Para evitar afectar la capa de muestra durante la adición de eluyentes, causando desigualidad, deformación y afectando la eficiencia de separación, generalmente se coloca una capa de sulfato de sodio anhidro o arena de cuarzo sobre la capa de muestra.
¡Nuestros ingenieros prefieren poner sulfato de sodio anhidro porque también tiene una función de secado y es amigable con los solventes como el diclorometano, que son propensos a la volatilización, la absorción de calor y la condensación!
Elución de gradiente, muestreo y recolección
Después de cargar, primero enjuague la columna con un pequeño solvente polar (un solvente que no permitirá que el producto pase) para los volúmenes de columna 2-3 (un volumen de una columna se define como el volumen de la fase móvil que fluye dentro y fuera) para garantizar la uniformidad, y luego seleccione una proporción para la elución.
¿Cómo elegir el eluyente que pasa a través de la columna?
La relación de eluent es la relación cuando su producto alcanza un valor de RF de aproximadamente 0. 2 en la placa TLC
Esta es la experiencia del lavado de columnas que he leído muchos libros y compartido, y el proceso real también es muy similar. Personalmente, prefiero reducir el gradiente en dos veces.
Por ejemplo, si el solvente para la escalada de placas TLC es PE/EA =2: 1, es más probable que el blogger inicie la elución de gradiente de PE/EA =4: 1 y termine en PE/EA =2: 1, generalmente resulta en mejores resultados.
También hay técnicas al recolectar eluent. Primero puede elegir un tubo de ensayo más grande para recibirlo, y cuando TLC se acerca al punto de destino, cambie a un tubo de ensayo más pequeño. Esto puede reducir la posibilidad de recibir más y evitar impurezas.
Si encuentra situaciones en las que los puntos de impureza y los puntos de producto están muy juntos, especialmente aquellos con fluorescencia débil, recuerde no aplicar presión. En su lugar, elija pasar la columna bajo presión normal y cambiar el tubo cada vez que se conectan la mitad o menos los tubos, lo que también puede aumentar la probabilidad de purificación.
¡Recuerde no manejar el pilar de manera oportuna!
Muchas personas tienen la costumbre de asumir que la columna se ha pasado y se secó cuando no hay producto en uno o dos tubos después de TLC en la etapa posterior.
Solo me di cuenta de que el rendimiento era demasiado bajo cuando lo calculé, o cuando fui a hacer un espectro, descubrí que el espectro era incorrecto y perdió el punto equivocado. Lo lamenté profundamente.
Por lo tanto, se recomienda que no se apresure a procesar la columna después de completar el punto deseado. En su lugar, realice una resonancia magnética nuclear para que coincida con el rendimiento antes del procesamiento.
Si está ocupado o tiene prisa por purificar otros compuestos con estecromatografía de columna convencional, se recomienda enjuagar con un solvente mixto benigno de alta polaridad y dejar esta parte del eluyente por separado para obtener resultados de identificación.
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